蛋白純化系統(tǒng)作為一種專門用于蛋白質(zhì)高效分離純化的儀器，在生物醫(yī)藥、科研機(jī)構(gòu)、生物技術(shù)等眾多領(lǐng)域都有著廣泛應(yīng)用。它能夠?yàn)榈鞍踪|(zhì)的研究和生產(chǎn)營(yíng)造精準(zhǔn)、純凈的操作環(huán)境。

蛋白純化系統(tǒng)的類型劃分多樣。根據(jù)分離原理的不同，可以分為：離子交換層析系統(tǒng)、凝膠過(guò)濾層析系統(tǒng)、親和層析系統(tǒng)等；按照操作模式來(lái)區(qū)分，有手動(dòng)、半自動(dòng)和全自動(dòng)等類別；從適用范圍來(lái)看，又可針對(duì)不同的蛋白質(zhì)特性和純化需求進(jìn)行細(xì)分。

今天我們要講的主題是AKTA蛋白純化常見的問(wèn)題與故障，喜歡的小伙伴歡迎 點(diǎn)贊 轉(zhuǎn)發(fā)哦~

一、蛋白純化的常見問(wèn)題

01  AKTA pure與prime plus的最大耐受壓力？ 

pure25是20Mpa，pure150是5Mpa；prime plus是1Mpa；紫外電導(dǎo)2MPa，pH電極耐壓0.5MPa。

02  如何設(shè)置報(bào)警壓力？ 

系統(tǒng)配有多柱位閥：

可以檢測(cè)柱子的柱前Pre C壓力，柱后Post C壓力，并且計(jì)算出Delta C壓力。

分別設(shè)置Pre Column Pressure和Delta Column Pressure的壓力報(bào)警保護(hù)柱子。 

系統(tǒng)無(wú)多柱位閥：

先用管道代替柱子連接設(shè)備，在工作流速下測(cè)定系統(tǒng)本身的壓力，此為空載壓力。

Pre Column Pressure為Max Pre-Column Pressure和Max Delta Column Pressure+空載壓力中較低值。

03  在正確設(shè)置了報(bào)警壓后，層析柱接入AKTA，總是超壓報(bào)警？ 

首先判斷AKTA系統(tǒng)是否本身壓力過(guò)高，在線濾膜或者反壓閥堵塞，正常情況下反壓閥空跑系統(tǒng)壓力為0.2左右。如果系統(tǒng)沒有問(wèn)題，接入柱子出現(xiàn)超壓，可能是柱子堵塞或者連接柱子的管線折彎造成超壓，調(diào)整連接管線或者按說(shuō)明書方式清洗層析柱。

04  柱子堵了，超壓如何處理？

可能是因?yàn)榫彌_液或樣品未進(jìn)行過(guò)濾、蛋白沉淀或雜質(zhì)殘留、清洗不及時(shí)等引起層析柱濾膜堵塞；流速過(guò)快、流動(dòng)相粘度 ( 如乙醇等 ) 過(guò)高、溫度過(guò)低。

解決方法：首先將柱子卸下來(lái)，確定是系統(tǒng)還是柱子堵了。如果是柱子堵了，參考說(shuō)明書 CIP 操作進(jìn)行清潔；更換層析柱頂端濾膜或超聲清洗。測(cè)定柱效或重復(fù)之前做過(guò)的樣品。后續(xù)，注意樣品前處理（如核酸的去除、樣品緩沖液條件）以及層析柱的日常維護(hù)。

05  柱子進(jìn)氣泡或跑干了，怎么辦？

可能是由于環(huán)境溫度變化；緩沖液未經(jīng)過(guò)脫氣；層析柱連接系統(tǒng)或操作不當(dāng)。

解決方法：可以用大量脫氣去離子水或 20% 乙醇反向高速?zèng)_洗層析柱，直到小氣泡被帶出（沖洗過(guò)程建議在系統(tǒng)連接反壓閥之后進(jìn)行）；如果大量進(jìn)氣，建議重新裝柱。

06  His 標(biāo)簽蛋白純化實(shí)驗(yàn)中，常用的緩沖液成分是什么？

建議緩沖溶液成分如下

結(jié)合緩沖溶液：

FF、HP系列：20mM磷酸鈉緩沖溶液， 500mM NaCl（避免非特異電荷吸附）， 20-50mM 咪唑（提高濃度，可以增加純度但會(huì)降低收率），pH7.4（可以根據(jù)實(shí)際情況調(diào)節(jié)pH）。 

Talon 系列：20mM磷酸鈉緩沖溶液， 500mM NaCl，10-20mM咪唑， pH7.4。

Excel 系列：20mM 磷酸鈉緩沖溶液，500mM NaCl，pH7.4（結(jié)合緩沖液中一般不添加咪唑，在wash緩沖液中可根據(jù)樣品性質(zhì)加入0-30mM 咪唑）。

洗脫緩沖溶液：

20mM 磷酸鈉緩沖溶液，500mM NaCl，500mM 咪唑，pH 7.4。

07  洗脫得到的 His 標(biāo)簽蛋白樣品的雜帶較多，純度不高，應(yīng)該如何改進(jìn)？

解決方法：

His 標(biāo)簽蛋白被部分降解：添加蛋白酶抑制劑（慎用 EDTA）；保持蛋白樣品在低溫下操作；縮短實(shí)驗(yàn)操作的時(shí)間，例如使用crude系列預(yù)裝柱省略離心澄清的步驟。 

雜蛋白對(duì)于金屬離子也有較強(qiáng)的結(jié)合：優(yōu)化結(jié)合、洗脫條件（咪唑濃度、 NaCl 濃度、 pH 條件等）；嘗試不同金屬離子螯合的填料（例如 Co2+：HiTrap TALON crude預(yù)裝柱和TALON Superflow 填料）；增加后續(xù)的純化步驟，例如離子交換、凝膠過(guò)濾等；構(gòu)建雙標(biāo)簽?zāi)康牡鞍走M(jìn)一步純化。

雜質(zhì)與目的蛋白存在相互作用而共洗脫：在細(xì)胞破碎前加入去垢劑或還原劑；提高Wash buffer中去垢劑濃度（2% Triton X-100或2% Tween 20）或添加甘油（20%以內(nèi)）以破壞非特異性相互作用；將緩沖液的鹽濃度提高至500 mM NaCl。

洗雜步驟不夠充分：重復(fù)洗雜的步驟使洗雜充分。

二、蛋白純化的常見故障

01  漏液怎么辦？ 

確定漏液位置，更換finger tight并更換管道線。

02  壓力異常應(yīng)該如何操作？ 

壓力偏低：漏液?jiǎn)栴}；矯正壓力檢測(cè)器；

壓力偏高：檢查在線濾器；矯正壓力檢測(cè)器；管道或者液體通過(guò)的模塊有堵塞；

壓力波動(dòng)：泵頭造成波動(dòng)；層析柱造成波動(dòng)；

檢查在線濾器：在線過(guò)濾膜片安裝在混合池里面，可以考慮更換在線膜片或者使用純水/NaOH超聲清洗；

矯正壓力檢測(cè)器：進(jìn)行零點(diǎn)校正；System Control—System—Calibrate—對(duì)壓力模塊進(jìn)行零點(diǎn)校正。

03  流速異常 

泵頭有氣泡：將閥中的液體和殘留的空氣抽掉，用乙醇沖洗泵；

單向閥工作不良； 

溶液中有氣體：溶液使用前應(yīng)脫氣后再使用。

04  紫外吸收異常排查 

氣泡干擾：用20ml/min流速?zèng)_洗流路，再換用0.5ml/min流速，檢查紫外吸收的變化；如果紫外變化高于2mAu，則可能流路中有氣泡，需要用高流速?gòu)南峦蠈馀輿_出； 

紫外流路池清潔：用注射器推甲醇/1M NaOH/10%表面活性劑注入紫外流動(dòng)池，停留20min，用水沖洗。

溫馨提示

如果遇到無(wú)法獨(dú)立解決的問(wèn)題，建議尋找專業(yè)的工程師上門排查解決~